研究簡介：肺表面活性劑（PS）是一種復(fù)雜的脂質(zhì)/蛋白質(zhì)混合物，覆蓋在肺泡的空氣-液體界面上，主要功能是降低表面張力，防止肺泡在呼氣末塌陷。PS的生物物理功能依賴于其獨特的成分，其中主要成分是二棕櫚酰-sn-甘油-3-磷酰膽堿（DPPC），還包含其他磷脂、膽固醇以及特定的蛋白質(zhì)，特別是疏水蛋白SP-B和SP-C。SP-B和SP-C雖然在PS中的總質(zhì)量占比不到1%，但對PS的生物物理功能至關(guān)重要。然而SP-B和SP-C在PS三維結(jié)構(gòu)形成中的具體作用機制尚不清楚。其功能依賴于在肺泡界面形成并維持一個復(fù)雜的單層膜及與之相連的亞表面多層膜（即“儲備庫”）系統(tǒng)，該3D結(jié)構(gòu)能夠在呼吸周期中實現(xiàn)脂質(zhì)的快速交換與補充。然而這一關(guān)鍵3D結(jié)構(gòu)形成的具體蛋白驅(qū)動機制尚不明確。

研究者使用了多種實驗技術(shù)，包括中子反射（NR）、表面壓力-面積（Π-A）等溫線、橢偏光測量和表皮熒光顯微鏡，來研究PS膜和薄膜在不同壓縮階段的結(jié)構(gòu)。實驗中使用了由DPPC、棕櫚酰油酰基-sn-甘油-3-磷酰膽堿（POPC）和棕櫚酰油酰基-sn-甘油-3-磷脂酰甘油（POPG）組成的模型PS膜，并在其中添加了10%的SP-B或SP-C。研究結(jié)果表明，SP-B在PS膜的三維結(jié)構(gòu)形成中起著關(guān)鍵作用，能夠穩(wěn)定界面并促進脂質(zhì)儲庫的形成。而SP-C雖然在脂質(zhì)交換中發(fā)揮作用，但需要SP-B的存在才能整合到界面結(jié)構(gòu)中。這些發(fā)現(xiàn)為理解PS在呼吸過程中的動態(tài)行為提供了重要的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，并為設(shè)計新一代優(yōu)化的臨床PS制劑提供了理論依據(jù)。

Kibron LB膜分析儀的的應(yīng)用

Kibron LB膜分析儀用于在受控條件下制備、壓縮和分析氣-液界面上的肺表面活性物質(zhì)模型膜，并與其他分析技術(shù)聯(lián)用。實驗前，LB槽體需用氯仿和超純水仔細清潔，然后注入170 mL的Tris-NaCl緩沖液（pH 7.4)。將溶解在氯仿/甲醇（2:1,v/v）中的脂質(zhì)或脂質(zhì)/蛋白質(zhì)混合溶液，使用漢密爾頓微量注射器鋪展在空氣-水界面上。在開始壓縮前，預(yù)留15分鐘讓溶劑完全蒸發(fā)。壓縮過程的速率控制在8.8 cm2?min?1。亞相溫度通過循環(huán)水浴維持在22.0±0.1°C。表面壓力通過使用濾紙制成的Wilhelmy吊片法壓力傳感器進行記錄。

LB膜分析儀可獲取表面壓力-面積（Π-A）等溫線，直接用于測量模型單層膜（純脂質(zhì)、脂質(zhì)+SP-B、脂質(zhì)+SP-C）的壓縮Π-A等溫線。等溫線顯示，所有系統(tǒng)在壓縮至約40 mN/m時均出現(xiàn)一個明顯的平臺區(qū)，這對應(yīng)于單層膜從二維向三維結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)變（buckling-dominated collapse），模擬了生理呼氣末期的膜重組過程。通過計算平臺區(qū)壓縮面積占總面積的百分比（%Aplateau），研究人員量化了SP-B和SP-C在穩(wěn)定三維結(jié)構(gòu)能力上的差異。結(jié)果表明SP-B系統(tǒng)的%Aplateau（35%）顯著高于SP-C系統(tǒng)（27%）和純脂質(zhì)系統(tǒng)（18%），直接證明了SP-B在促進和穩(wěn)定膜儲備庫形成方面具有更強大的能力。與橢圓偏振測量聯(lián)用，研究中，將Beaglehole Picometer Light Ellipsometer與Kibron G2槽聯(lián)用，實時監(jiān)測壓縮過程中光學(xué)參數(shù)d△的變化。

實驗結(jié)果

提出的結(jié)果清楚地證明了蛋白質(zhì)SP-B在壓縮下成核和穩(wěn)定3D界面多層儲層的關(guān)鍵作用，而SP-C的作用似乎是輔助的——促進脂質(zhì)交換，但需要SP-B來結(jié)構(gòu)整合到界面結(jié)構(gòu)中。從表面循環(huán)前后的中子反射法的可比剖面推斷出，這些SP-B促進的儲層一旦受到類似呼吸的壓縮-膨脹動力學(xué)，就會與界面穩(wěn)定地結(jié)合。然后SP-B被證實是維持肺泡空間PS薄膜復(fù)雜結(jié)構(gòu)的關(guān)鍵分子。本工作連接了早期的分子模擬和生理學(xué)研究，為SP-B獨特的界面重塑能力提供了直接的實驗證據(jù)，這與之前關(guān)于SP-B對呼吸和生命至關(guān)重要的知識一致。未來結(jié)合氘代蛋白、生理脂質(zhì)混合物和全組合蛋白質(zhì)補體的工作將完善對PS動力學(xué)的理解，對設(shè)計新一代優(yōu)化的臨床PS制劑以治療尚未解決的表面活性劑缺乏性肺部疾病產(chǎn)生影響。

圖1、實驗方法的示意圖總結(jié)。A)將肽溶液制備成DMF。B)在空氣-水界面處沉積并使用LB裝置進行壓縮。C)轉(zhuǎn)移到云母基材上。D)用金屬鹽選擇性浸漬并用UV/O3去除肽。

圖2、A)FP1和FP2肽的化學(xué)結(jié)構(gòu)。FP1（B和D）和FP2（C和E）肽LB膜的AFM顯微照片分別在無壓縮（B和C）和20 mN m-1（D和E）的情況下轉(zhuǎn)移到新鮮切割的云母基底上。F,G)導(dǎo)致纖維形成的肽β-折疊二級結(jié)構(gòu)的示意圖。H)在這項工作中研究的樣品的LDIR光譜。I)將酰胺I帶解卷積為其主要成分。

圖3、A)在空氣/水界面上鋪展的FP2肽的壓縮等溫線π–A以及在3、10、20和30 mN m?1下獲得的LB肽膜的AFM顯微照片（分別為B、C、D和E））。

圖4、A)用于擬合NR數(shù)據(jù)的模型示意圖。B)10、C)20和D)30 mN m-1處界面的密度分布。E）通過NR獲得的纖維的總厚度。F)界面剪切流變測量。G)通過分析AFM圖像獲得纖維的間距和曲率。

圖5、從35 mN/m處的擬合獲得的結(jié)構(gòu)參數(shù)分別表示每層的厚度和水體積分數(shù)。ΔSLD（%）表示擬合SLD與理論SLD值之間的百分比差。

總結(jié)

自發(fā)現(xiàn)以來，破譯呼吸氣液界面處肺表面活性劑（PS）的分子結(jié)構(gòu)一直是一項重大挑戰(zhàn)。這在呼氣結(jié)束時的最小肺容積和表面積下尤為重要，此時PS會迅速重組為3D膜網(wǎng)絡(luò)而不會與界面膜分離，從而確保后續(xù)呼吸周期的準備和穩(wěn)定性。研究人員利用中子反射法和落射熒光顯微鏡在專門設(shè)計的表面天平中，研究了模型PS膜和薄膜在不同壓縮階段的結(jié)構(gòu)，重點關(guān)注疏水表面活性劑蛋白SP-B和SP-C在界面系統(tǒng)組織中的關(guān)鍵作用。所研究的模型表面活性劑薄膜的結(jié)構(gòu)（均與界面平面正交和橫向分析）在很大程度上取決于成分。闡明了SP-B和SP-C的不同作用，揭示了只有SP-B（表面活性劑中唯一對生命不可或缺的蛋白質(zhì)）在界面下方的3D膜庫成核。

Kibron LB膜分析儀（及同類型Langmuir槽）在本研究中是不可或缺的基礎(chǔ)工具。它不僅是獲取膜宏觀力學(xué)性能（如Π-A等溫線）的主要設(shè)備，更是一個多功能平臺，通過與其他技術(shù)（橢圓偏振、NR）聯(lián)用，實現(xiàn)了對界面膜結(jié)構(gòu)、組成和動態(tài)行為的原位、實時、多尺度分析。該設(shè)備的精確控壓能力，為最終通過中子反射技術(shù)直接觀察到SP-B特異性的3D儲備庫結(jié)構(gòu)提供了關(guān)鍵且可靠的實驗條件，從而有力地支撐了本研究的核心結(jié)論。本研究首次通過中子反射等技術(shù)在納米尺度上直接證實了SP-B是肺表面活性物質(zhì)在肺泡界面形成和維持3D膜儲備庫的關(guān)鍵“建筑師”，而SP-C則扮演輔助角色。這一發(fā)現(xiàn)從結(jié)構(gòu)生物學(xué)的角度深刻揭示了PS維持呼吸力學(xué)穩(wěn)定的分子基礎(chǔ)，不僅與SP-B基因缺失致死、而SP-C缺失導(dǎo)致慢性呼吸問題的生理現(xiàn)象相吻合，也為未來開發(fā)治療呼吸窘迫綜合征等肺表面活性物質(zhì)功能障礙疾病的更優(yōu)仿生制劑提供了關(guān)鍵的理論依據(jù)和新的設(shè)計思路。